Астрономия и микроскопия

Ниче не пойму, сделал разведение с дистиллированной водой купленной в автомагазине, на общий просвет мазок фиолетово-красный, под 400х эритроциты фиолетово красные, но ни один лейкоцит не окрасился.
В первый раз делал разведение бутилированной водой и красил 25 мин, и лейкоциты окрашивались, а сейчас развел дистиллированной и красил 45 мин. Могло удлиненное время окраски обесцветить лейкоциты?

Чем фиксировали мазок? Во сколько раз разводили краситель? В домашних условиях, возможно, лучшим фиксатором будет ацетон. Фиксация 96% этанолом мне самому не очень нравится.

_________________
Микмед-2, Бимам, Биолам

Фиксировал 96% этиловым спиртом. Но в первый то раз так же фиксировал и окрасилось,только вот цвет был сдвинут в синюю сторону. Единственное отличие это тогда раствор разводил бутилированной питьевой покупной водой, а так же 1:10.
А ацетоном каким? Обычным техническим из магазина? И сколько минут?
На что может повлиять плохая или неправильная фиксация?

96% этанол должен вполне удовлетворительно сохранять лейкоциты. Если даже и не все, то большую часть, это точно. Для хороших результатов, вероятно больше пригоден безводный этиловый спирт. Ещё лучше фиксирует безводный метанол, но достать его трудно.
Ацетон, чем чище, тем лучше) Как повлияют примеси на качество фиксации и окраски я не мрогу сказать. Тут нужно только пробовать и смотреть на результат. Возможно и технический ацетон для фиксации вполне подойдёт. Ацетоном фиксируют, по-моему около 5 минут. Я никогда ацетон не использовал для фиксации, но на днях сам хочу попробовать качество фиксации мазков крови ацетоном. О результатах напишу.
Вообще, я пробовал с разными партиями красителя разведение 1:1 или 1:2 с дистиллированной водой. Результат всегда был хороший - эритроциты получались розового цвета с небольшим оттенком оранжевого цвета, лейкоциты тоже всегда хорошо прокрашивались. На этом форуме, где-то выложено пособие по гематологии, там всё подробно написано про окраску и фиксацию мазков крови.

_________________
Микмед-2, Бимам, Биолам

Делал фиксацию ацетоном 5 минут, то же самое,лейкоциты не окрашены,вода всё таже дистиллированная из автомагазина,более того после ацетона мазок с легкостью смывался со стекла, после этилового же спирта мазок держался весьма крепко на стекле. Попробовать надо снова как в первый раз на бутилированной воде разбавить краску, для подтверждения результата.

И опять появился вопрос: кто скажет, при окраске по Граму, сафранин во флаконе 2%. Нужно ли его разводить до 0.25% ?

Сафранин очень легко вымывается при последующем обезвоживании спиртом, поэтому не надо его разводить, с сафранином надо ещё уметь работать.

Ну так сафранин как второй краситель. Почему-то от фиолетового и следа не остается, всё окрашено в красный.И обесцвечивание спиртом делал по минимуму, а всё-равно потом всё красно.

То что вы покупаете вода "дистиллированная" в бутылках, а тем более в канистрах ей не является. НА какой-то приличный результат без забуференной воды не приходится. Если вы красите по Романовскому, видимо АЗУР-II в вашей воде и претерпевает какие-то изменения поэтому и не окрашивает ядра лейкоцитов. Фиксация тоже дело отвественное спирт если вы покупали его как антисептический раствор, может содержать примеси, по опыту скажу если это он, то его нужно перегонять, и бывают партии которые в конце отгонки содержать осадок. Мазок оставьте на час в вашем спирте, и не красьте сразу, а высушите мазок перед и после фиксации, желательно при градусах 30С

_________________
мой сайт http://labx.narod.ru/
Polyvar, Zeiss Imager Z1, Jenaval, Микротом Reichert Jung Biocut 2030, К.М.Н. 14.03.02

Спирт купил у человека который поставляет спирт в мед учреждения в 5-литровых бутылях, написано 96%.
А фиксировать час не пробовал,надо проверить.

Да, сафранин разводите водой примерно до 0,25%. Если красить по Граму в модификации Хукера, то там используют раствор сафранина именно с такой концентрацией. Но окрашивает он бледнее, чем фуксин. Можете попробовать окрашивать более концентрированным раствором сафранина, сократив время окраски. У нас в России принято в качестве дополнительного красителя использовать основной фуксин. Сафранин больше встречается в американских руководствах. Но большой разницы каким красителем докрашивать нет. Можно использовать для этих целей нейтральный красный.
Обесцвечивание в спирте при окраске по Граму очень ответственный этап. Время необходимое для обесцвечивания мазка в спирте варьирует в разных методиках. Для начинающих довольно хороший результат даёт погружение мазка в 96% спирт ровно на 15 сек. (время засекаете по секундомеру) и после этого сразу же сразу хорошо промываете водой.
Даже при соблюдении всех условий бактерии грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, а грамотрицательные - как грамположительные.

_________________
Микмед-2, Бимам, Биолам

Но странно, после спирта и промывки водой видно же на стекле что мазок окрашен темно синим(часть мазка), а почему же тогда эти же участка потом становятся красными? Если они УЖЕ удержали в себе синий цвет,почему они же потом перекрашиваются в красный?

По цвету мазка сложно узнать, можно ошибиться. Надо смотреть именно микроскопическую картину. Если бактерии окрасились кристаллическим фиолетовым (или другим близким красителем) и при последующей обработке спиртом не обесцветились, то вероятно, большое количество нового красного красителя они не поглощают, по-крайней мере, так принято считать. Но на самом деле, если даже бактерия окрасилась, как ей полагается, в тёмно-фиолетовый цвет, она, конечно же, ещё поглощает небольшое количество сафранина или фуксина, но красный цвет маскируется тёмно-фиолетовым цветом первого красителя и внешне создаётся впечатление, что красным красителем она не прокрашивалась.
Если бактерия прокрасилась кристаллическим фиолетовым и раствором Люголя и весь это красящий комплекс не вымылся спиртом, то при последующей окраске водным раствором дополнительного красителя, фиолетовый цвет никуда не должен деться, комплекс кристалливолета и йода из бактериальной клетки водой так легко не вымывается.

_________________
Микмед-2, Бимам, Биолам

Ну если попробовать увеличить экспозицию первым красителем попробовать,и сократить до 3-5 секунд экспозицию в спирте.
А вот такой способ по Романовскому кто-нибудь пробовал ?
Модификация окраски мазков крови краской Романовского — Г имза по Филипсону. Для окрашивания по этому методу требуется особое приготовление краски, которое можно производить заранее, но можно и в момент окрашивания. Берется одна часть жидкой краски Романовского и три части этилового спирта (ректификата). После смешивания со спиртом краска сразу же пригодна для употребления.
На нефиксированный мазок крови наносится 10—15 капель приготовленной вышеуказанным способом краски. Через 10—15 минут, необходимых для фиксации мазка, наливается примерно 0,5—1 мл дистиллированной воды, которая тщательно смешивается с краской. Окрашивание мазка продолжается в течение 20—30 минут (длительность периода окрашивания изменяется в зависимости от температуры воздуха, качества краски и некоторых других причин и может быть установлена в каждой лаборатории самостоятельно). Затем краска смывается дистиллированной водой и мазок высушивается. Высохший мазок годен для исследования.

В общем покрасил по методу Филипсона и всё получилось,с дистиллятом из автомагазина, в точности как красил в самый первый раз с бутилированной водой,лейкоциты достаточно хорошо прокрасились, эритроциты бледно-розового цвета со слегка голубым оттенком.
Метод явно лучше работает нежели оригинальный.