Астрономия и микроскопия

Добрый день!

Артур, я выполняю твою просьбу

Краткое руководство по комбинированной окраске и приготовлению микроскопических постоянных препаратов в области анатомии растений.

При изготовлении постоянных препаратов для микроскопического анализа тканей растений важная роль отводится комбинированной окраске. Она позволяет на одном препарате выявить различные ткани для более детального изучения их анатомических особенностей. Окраска основана на разном сродстве тех или иных клеточных структур к различным красителям [Барыкина и др., 2004]. Так, лигнифицированные клеточные оболочки, имеющие кислую реакцию, хорошо окрашиваются основными красителями, а нелигнифицированные клеточные оболочки – кислотными.
Как правило, комбинированная окраска тканей растений двуцветная, получаемая с помощью двух контрастных по цвету красителей. Наиболее применимы следующие пары красителей: сафранин и водный синий, сафранин и водный зелёный, хризоидин и светлый зелёный и т.п. Наиболее известна и проста в применении комбинированная окраска по Этцольду [Etzold, 1983]. Это смесь трёх красителей в 2%-й уксусной кислоте: основной фуксин (1:10 000), сафранин (1:2500), водный синий (1:1000). В 2002 году Этцольд модифицировал свой метод окраски и предложил заменить сафранин хризоидином [Etzold, 2002]. Эта смесь также проста в применении, долго хранится.
С публикацией Робином Уокером нового метода полихромной окраски тканей растений для световой и флюоресцентной микроскопии [Wacker, 2006], вновь возрос интерес к применению акридиновых красителей в ботанической микротехнике. Уокер предложил использовать для окраски срезов растительных объектов следующие растворы красителей: акридиновый красный (1% раствор в 50% этаноле), акрифлавин (1% раствор в дистиллированной воде), астра-синий (1% раствор в дистиллированной воде). Акридиновый красный и акрифлавин являются также флюорохромами. Достоинством этого нового метода является насыщенность окраски клеток с лигнифицированными оболочками и возможность наблюдения препаратов с помощью люминесцентного осветителя. Сложность применения этого метода для многих исследователей состоит в поэтапном применении трёх красителей и необходимой дифференциации окраски. Метод был рекомендован для окраски объектов, прошедших проводку и заливку в парафин. Как известно, для процесса проводки, пропитки, заливки и резки на микротоме необходима специализированная лаборатория с дорогостоящим оборудованием. Кроме того, для депарафинизации срезов необходимо использование вредного для организма ксилола.
Весной 2011 года мы приняли решение модифицировать метод Уокера, провели серию экспериментов по приготовлению постоянных препаратов. Основной целью работы являлось упрощение нового метода полихромной окраски.

Приготовление препаратов – это целый ряд последовательных этапов, количество которых зависит от поставленных задач, в том числе, какие вы готовите препараты - временные или постоянные. В данном случае, я уделю внимание изготовлению постоянных препаратов, но БЕЗ проводки, пропитки и заливки в парафин, изготовления парафиновых блоков и т.п. Примеры приведу на научных работах обучающихся в нашей исследовательской лаборатории «Микрокосмос».

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

И так, считаем, что вы подготовили рабочее оборудование. красители и др.




Материалы, оборудование.
Фиксированный или свежий растительный материал
Реагенты.
Готовые красители: акридиновый красный (Acridinrot), акрифлавин (Acriflavin), астра-синий (Astrablau), толуидиновый синий (Toluidinblau), альциановый зелёный (Alciangruen), хризоидин (Chrysoidin). Дистиллированная вода, этиловый спирт разной концентрации (70%, 50%, 30%), изопропиловый спирт 99, 7%, формалин (40%), ледяная уксусная кислота(99.5%), монтирующая среда Euparal.
Оборудование.
микроскопы, ручной цилиндрический микротом или салазочный, одноразовые лезвия для микротомов, держатель одноразовых лезвий, часовые стёкла, чашки Петри, предметные и покровные стёкла, кисточки, препаровальные иглы, нагревательный столик, песочные часы, пинцеты, держатели, спиртовка, пипетки, термостат, блоки из стиропора, корнеплодов моркови.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Основные этапы приготовления препаратов:

1. Выбор объекта и его подготовка: сбор, нарезка, фиксация.

Выбраны объекты: либо это стебли, либо листья, либо рахисы папоротников и т.д.
Есть два способа заготовки материала:
1) Нарезать кусочки стеблей, черешков длиной около 2 см и сразу поместить их в фиксатор на 5-7 суток.
2) Отрезать кусочки стеблей, литьев перед самой процедурой резки на микротоме, а затем тонкие поперечные срезы поместить в фиксатор.

Рекомендуемый фиксатор – FAA: этиловый спирт 96% - 100 мл.; формалин – 7 мл., ледяная уксусная кислота – 7 мл. Материал в этом фиксаторе можно держать до недели, а затем промыть этиловым спиртом и поместить 70%-й этиловый спирт.
На фото как мы храним заранее фиксированный летом материал.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

2.Приготовление рабочего места для изготовления препаратов.

Важно, чтобы во время приготовления постоянных препаратов вам никто не мешал, это опасно для рук во время резки материала на ручном микротоме или с помощью лезвий для бритья. Необходимо заранее сделать влажную уборку помещения, чтобы было меньше пыли и т.п.
Всё необходимое оборудование, реактивы, красители заранее проверяют перед работой.

3. Резка материала

Поперечный срез растительного материала можно проводить:
1) с помощью бритвы вручную.
С помощью резки обычной опасной бритвой или лезвиями для бритья можно добиться вполне пригодных для изучения срезов толщиной 50-100 мкм, но надо «набить руку». Для резки твёрдого материала этот способ почти не пригоден, такие объекты необходимо заранее размягчить.
Для объектов надо изготовить держатель - оправку. Можно использовать корнеплоды моркови, сердцевину стебля бузины, стиропор, стиродур и т.п. То есть, материал для оправки надо подобрать так, чтобы твёрдость объекта приблизительно соответствовала твёрдости держателя (оправки).
В оправке вырезаем углубление в соответствие с формой объекта, закрепляем и плавными скользящими движениями нарезаем объект.
Такую же оправку можно использовать, если вы используете ручной или ротационный микротом.


1 - Ручной микротом с микровинтовой подачей.
2 - Держатель одноразовых лезвий
3 - Одностороннее лезвие для научной работы

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

2) Резка с помощью ручного цилиндрического микротома или салазочного микротома.
Зажимаем объект в оправке, вставляем в микротом, выравниваем объект путём 1-2 срезов, регулируем толщину среза с помощью микровинта, смачиваем водой объект и лезвие, плавно двигаем лезвие, срез снимаем мягкой тонкой кисточкой.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

4.Подготовка материала к окраске.

Если срезы делаем со свежего, а не фиксированного материала, то рекомендую следующий рабочий план:

• сами срезы сразу помещаем в фиксатор FAA на 15-20 минут.
• далее cрезы промываем в 70% этаноле 3 минуты.
• срезы промываем в 50% этаноле 3 минуты.
• срезы промываем в 30% этаноле 3 минуты.
• срезы промываем в дистиллированной воде и оставляем их там до этапа окраски.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

5.Окраска срезов.

В данном примере привожу модифицированный нами метод окраски Уокера – смесь №1 (см. выше). Естественно, можно выбрать более простой вариант комбинированной окраски. Особенно проста комбинированная окраска по Этцольду (см. выше). Там достаточно пару капель на срез, подержать срез в смеси красителей 15 минут, промыть от остатков красителей и можно далее изготовить временные препараты (помещаем окрашенный срез в каплю воды на предметном стекле, накрываем покровным и смотрим при малом увеличении микроскопа, затем при большом увеличении), можно и постоянные.

Метод полихромной окраски с применением акридинового красного, акрифлавина, астраблау был опубликован Уокером в 2006 году, сам метод рекомендован для окраски срезов после заливки в парафин. Этот метод для хорошо подготовленных специалистов или продвинутых любителей. Пока его редко используют.
Мы модифицировали этот метод, чтобы окраску можно было проводить всем, кто пожелает это делать. Кроме того, все красители нами смешиваются, несмотря на то, что обычно не рекомендуют это делать в виду химической реакции между красителями и выпадения осадка.

Срезы помещали в часовые стёкла, куда предварительно наливали растворы красителей, считая капли (см. выше смесь №1).

Затем эти красители смешивали между собой и добавляли дистиллированную воду.
В эту смесь помещали срезы.



Для ускорения реакции окраски часовые стёкла нагревали над огнём спиртовки до 50-60 ºС в течение нескольких секунд, после чего процесс окраски продлевали до 15-20 минут при комнатной температуре или помещали на нагревательный столик.



Затем раствор красителя сливали и промывали срезы в дистиллированной воде несколько раз, пока не станет видно, что излишки красителей уже не вымываются.



А далее идёт процесс дифференцировки окраски - это отмывка лишнего красителя и получение необходимого оттенка окраски тканей. Этот процесс проводили в течение 10-50 секунд (время зависит от многих факторов) в подкисленном соляной кислотой 70 %-ом этаноле. Эту процедуру следует проводить при непосредственном контроле через стереомикроскоп. Процесс дифференцировки можно проводить подкисленной дистиллированной водой, но этот процесс более продолжителен по времени.
Этот процесс наиболее важен и подбирается опытным путём...

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

6.Обезвоживание материала.

Мы полностью исключаем батарею спиртов разной концентрации, заменив их почти 100%-м изопропиловым спиртом. Работаем по следующей схеме:
- 10 сек. в изопропаноле – смена раствора;
- 30 сек. в свежем изопропаноле– смена раствора;
- 3 мин. в свежем изопропаноле – смена раствора;
- 5 мин. в свежем изопропаноле – смена раствора.


Срезы оставляем в изопропаноле, пока готовимся к следующему этапу.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

7. заключение в монтирующую среду.

Если у вас монтирующая среда типа канадского бальзама или малинола, то изопропиловый спирт необходимо заместить ксилолом (помните о вентиляции!).
Если вы используете монтирующую среду типа Эупараль, то эта среда совместима с изопропиловым спиртом.

На заранее подготовленные (обезжиренные, промытые) и подписанные предметные стёкла наносим 1-2 капли монтирующей среды, мягкой тонкой кисточкой переносим в неё заранее выбранные хорошие срезы, слегка их прижимаем к стеклу, располагаем срезы как нам необходимо и накрываем покровным стеклом (помните, что покровное стекло надо ставить на ребро, окунув в монтирующую среду, а затем плавно опускать стекло, чтобы не было пузырьков воздуха). Покровное стекло слегка придавливаем обратной стороной кисточки, помещаем на него небольшой груз и ставим препараты в тёплое место, где меньше пыли. Обычно монтирующие среды подсыхают около 5-7 суток.





Можно помещать препараты на нагревательный столик или также в термостат.


Излишки монтирующей среды, попавшие на предметное стекло, можно аккуратно срезать лезвием.
Готовые постоянные препараты надо просмотреть, наклеить бирочку с текстом: название объекта, дата сбора и окраски, метод окраски, автор работы и т.п.
Препараты лучше хранить в специальных коробочках.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

В результате применение раствора № 1 : клетки паренхимы, флоэмы окрашиваются в оттенки синего и сине-зелёного цвета, клетки склеренхимы - оранжево-красного или тёмно-розового цвета, клетки гиподермы – синего или розового цвета (зависит от склерификации), лигнифицированные клетки ксилемы окрашиваются в различные оттенки красного, кутикула жёлтая, таннины – тёмно-красные, трихомы – жёлтые, зелёные, красные.

Посмотрим, что у нас в результате получилось по окраске поперечного среза побега барбариса:


Следующая модификация:
раствор №2А: Акридиновый красный – 1 % раствор в 50 % этаноле; акрифлавин – 1 % раствор в дистиллированной воде; альциановый зелёный - 1% раствор в дистиллированной воде. Все три раствора красителей смешивали в соотношении 2:2:8, далее добавил к ним 8 частей раствора хризоидина. Перед применением в раствор добавили 30 ч. дистиллированной воды.
Смотрим окрашенный поперечный срез барбариса:


И совершенно новый авторский раствор:
№3. Акридиновый красный – 1 % раствор в 50 % этаноле; толуидиновый синий – 1 % раствор в дистиллированной воде; альциановый зелёный – 1 % раствор в дистиллированной воде; хризоидин – 1 % раствор в дистиллированной воде. Растворы красителей смешивали непосредственно перед окраской срезов в пропорции 2:4:12:8 и добавляли к раствору 30 ч. дистиллированной воды.

Смотрим окрашенный поперечный срез побега барбариса:

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Ух ты спасибо красители уже заказал когда придут буду пробовать.

Великолепный материал. Спасибо, Aktis!!

_________________
мой сайт http://labx.narod.ru/
Polyvar, Zeiss Imager Z1, Jenaval, Микротом Reichert Jung Biocut 2030, К.М.Н. 14.03.02

Спасибо!

Подведём некоторые итоги:

Микроскопическое изучение окрашенных тканей растений позволяет сделать выводы о том, что модификация нового метода полихромной окраски тканей растений имеет ряд положительных моментов:
1. экономия реактивов для фиксации и проводки материала;
2. существенная экономия времени для изготовления постоянных микропрепаратов;
3. исключение из процесса изготовления постоянных препаратов вредного для организма ксилола;
4. доступность метода.

Список литературы
Барыкина Р.П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. 312 с.
Михальцов А.И. Модификация нового метода полихромной окраски тканей растений. Природные ресурсы, биоразнообразие и перспективы естественнонаучного образования: Материалы международной научно-практической конференции, посвящённой памяти И. В. Бекишевой – учёного и педагога. Омск, 2012. – с. 57 – 59
Etzold H. Eine kontrastreiche, simultane Mehrfachfärbung für pflanzenanatomische Präparate: Fuchsin-Safranin-Astrablau // Mikrokosmos, Jg. 72, 1983, S. 213-219.
Etzold H. Simultanfärbung von Pflanzenschnitten mit Fuchsin, Chrysoidin und Astrablau // Mikrokosmos. Jg. 91, 2002, S. 316-322.
Wacker R. Eine neue und einfache Methode zur polychromatischen Anfärbung von Paraffinschnitten pflanzlicher Gewebe für Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie // Mikrokosmos Heft. 2006, № 4. S. 210-212.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Великолепно! Отличные методики и фото!

_________________
Биолам Р11 с АПО и УФ объективами с СТ11, КФ-1 и КФ-4, Гамма 3D, АУ-26, Laboval 4 с Phv ахроматами, Peraval interphako, MB30 с ДИК и ФК KFZ (частично KFA и KFS), Биомед с набором ПЛАН ФК, Jenamed 2 с ФК

Уважаемый Aktis!
Спасибо за исчерпывающие материалы и за ответ мне по этой же теме в другой ветке!