Алексей Лк писал(а):
Mildi писал(а):
У меня только один вопрос. Как может падать разрешение при освещении снизу если свет возбуждения при люминисценции не используется для построения изображения? К нему только одно требование равномерно осветить объект.
Вот не знаю. Значит как то используется. В формуле Аббе о разрешении микроскопа есть такой показатель n - показатель преломления среды. И если возбуждающий свет снизу проходит через два стекла (толстое предметное, тонкое покровное+сам объект), а не через одно (тонкое покровное + сам объект), то этот показатель наверное может меняться, и соответсвенно меняться само разрешение. Я не физик-оптик, я лишь предполагаю. Но факт с 200нм шариками имеет место быть, любой может сам проверить. Мне была бы как раз интересна независимая проверка, а то вдруг я чего не так понял или сделал
Я помню я совместил плоемопак и оптоволокно и прям на одном препарате это все проверял, просто меняя свет между волокном снизу и плоемопаком сверху, и у меня черный фон (оптоволокно) менялся на яркий с шариками (плоемопак). При освещении же оптоволокном сверху под углом шарики снова становились видны. 200нм это кстати самая грань разрешения микроскопа, может на 300нм например этот эффект освещения снизу уже и не распространяется. Свет это вообще самое темное место в физике
PS. Шарики на Али продаются, флуоресцентные шарики или частицы называются, до 100нм диаметр даже возможен
По неясным причинам этот тест с шариками в русскоязычной литературе почти никак не описан, и потому тут он мало известен
Может быть дело не в разности показателей преломления при освещении снизу или сверху, а в том, что степень рассеяния света, испускаемого шариком меняется? Теоретически?
Ещё вопрос - а интенсивность индуцирования флуоресценции при вариантах "снизу" и прочих - как различается? От неё ведь зависит очень много.
Есть ещё такие мысли вслух:
понятно, что 200 нанометров это за пределами разрешающей объективов 20х и 50х с обычными для них апертурами, но мы знаем, что можно наблюдать объекты за пределами разрешения, если они достаточно обособлены, т.е. расстояние между ними превышает линейное разрешение объектива. Потому мы и видим точки рассеяния от шариков. Если у вас объектив 50х0.80, то при длине волны света порядка 450nm его разрешение около 280nm, так что и в этом случае 200nm - за пределами разрешающей способности системы. Даже если бы он у вас был с предельной сухой апертурой 1 - всё равно, не более 225nm при такой длине волны света.
И тут есть вот какая засада. По результатам кое-каких своих проб, правда вне флуоресценции, я обратил внимание на то, что всё-таки очень важно - наблюдаемые частицы у нас сопоставимы с разрешающей оптики или за пределами её. Потому как если за пределами, то рассеяние света/точки во-первых, сильно искажает (увеличивает) её размер - значительно сильнее, нежели когда она сопоставима с разрешением объектива, а во-вторых, её свечение рассеивается сильнее и оно куда менее контрастно, чем у точек на уровне разрешения объектива, причём особенно на более сильном объективе, из-за в т.ч. часто переизбыточного семплирования.
Не знаю, как сформулировать короче и глаже, но может натолкнёт на какие идеи. В общем - вопрос таков: возможно ли, что кажущаяся потеря разрешающей при индуцировании "снизу" - именно кажущаяся из-за того, что объекты получают интенсивность "облучения" более низкую, чем при прочих вариантах и это усугубляется тем, что их свечение более сильно рассеивается, нежели могло бы, из-за того, что объекты из-за дифракции выглядят крупнее, чем есть, потому как находятся за пределами разрешения и в целом имеют потому изначально более слабый контраст, нежели могли бы? Т.е. происходит катастрофическое падение контраста из-за комплекса причин, в т.ч. недостаточной интенсивности "облучения", изначально сильного рассеивания, усугублённого и размером частиц меньше предела разрешения объектива.
P.S. Нет ли ссылочки на али, на шарики 200 нанометров?
Я пробовал измерять и наблюдать объекты точечные за пределами разрешения некоторой оптики, довольно сильной, но не во флуоресценции, так что вопросы выше продиктованы этой практикой, но было бы интересно попробовать и с флуоресценцией... Но мои такие объекты не флуоресцируют.
Вход
Регистрация
FAQ
Поиск
