Астрономия и микроскопия
http://forum.shvedun.ru/

Протокол фиксации клеток
http://forum.shvedun.ru/viewtopic.php?f=6&t=2047		 Страница 1 из 1
Автор:  balachoff [ 15 окт 2014, 01:19 ]
Заголовок сообщения:  Протокол фиксации клеток
Недавно встала задача фиксации культуры клеток для ПЭМ. На самом деле, образец будет изучаться АСМ, но до использования ультрамикротома порядок действий одинаковый.

Нашёл такой протокол:
http://www.jeolusa.com/DesktopModules/B ... &TabId=320

В принципе, хороший протокол, но не все реактивы есть. В частности нет пропилен оксида и марок указанных в протоколе смол. Есть обычная эпоксидка ЭДП. Есть ли другие хорошие протоколы для этой задачи? Слышал, что вместо пропилен оксида можно использовать ацетон, либо лиофильную сушку.

Ещё был бы благодарен, если бы подсказали протокол фиксации для СЭМ. Пока я делаю так: фиксирую 10% формалином (глутаровый альдегид скоро придёт), провожу через батарею спиртов, а потом просто высушиваю. В оптический микроскоп отлично видно (правда клетки деформированы). А вот в СЭМе получается очень низкоконтрастное изображение. Фотки скоро скину.
Автор:  balachoff [ 15 окт 2014, 17:59 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
Вот что у меня получается на СЭМе. Клетки неконтрастные, плюс присутствуют какие-то белые артефакты.
Изображение
1.jpg
Изображение
4.jpg
Автор:  Melarsoprol [ 15 окт 2014, 20:27 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
Приобретите книжку Гольдин. Основы гистологической техники электронной микроскопии-старая, но очень полезная. могу еще подарить субмикроскопические структуры клеток в норме и патологии-там есть немного приготовления
Автор:  Юрий [ 16 окт 2014, 10:57 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
Электронная микроскопия для начинающих. Уикли Б.М.-1975.djvu
https://yadi.sk/d/NpBMSj8panNct

Вы из МИФИ?
Автор:  Duke [ 16 окт 2014, 14:37 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
Я СЭМ занимаюсь 10 лет. Мне не понятно чего вы хотите добиться. Изучать клетки на СЭМ есть смысл только с детектором на просвет. У вас же детектор вторичных электронов.
Вы сами что ли на нем работаете? Это было бы удивительно, потому, что по всей видимости вы не понимаете принципов электронной микроскопии и в частности СЭМ.
Для изучения морфологии клеточных мембран можно исследовать во вторичных электронах на криостоле под низким вакуумом, но для этого клетки для начала надо золотом или другим металлом покрыть. На ваших фото я вообще картинки не вижу.
На обычном СЭМ (без просвета) можно исследовать только морфологию поверхности, как и в случае АСМ. Правда в контактном режиме или полуконтактном с сферойдом на кантилевере АСМ может "прощупать" клетку и если запись вести в упругости, можно разглядеть ионные каналы и органеллы. Но опять же непонятно, что вы пытаетесь изучить и зачем для этого использовать дорогостоящее оборудование, не предназначенное для такого рода исследований.
Автор:  balachoff [ 16 окт 2014, 16:31 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
Открою секрет, я студент старшего курса. Сейчас у меня задача исследовать структуру кардиомиоцитов методом АСМ. Для этого я фиксирую клетки, заливаю их в эпоксидку, а потом режу ультрамикротомом. Пока нормальных реактивов для фиксации у меня нет, поэтому я спрашивал, не знает ли кто другие методы фиксации.

А с СЭМ у меня задачи смотреть клетки не было. Его мы иногда используем для контроля кремниевых подложек и волокон. Ради интереса решил посмотреть клетки. Металлом предварительно покрыл. Но почему-то, их плохо видно. Всё-таки они довольно толстые. Хочу теперь попробывать метод заморафивания скалывания.
Автор:  balachoff [ 16 окт 2014, 16:32 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
Юрий писал(а):
Электронная микроскопия для начинающих. Уикли Б.М.-1975.djvu
https://yadi.sk/d/NpBMSj8panNct

Вы из МИФИ?

МФТИ
Автор:  20130403 [ 16 окт 2014, 16:48 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
balachoff писал(а):
Открою секрет, я студент старшего курса.


Добро пожаловать :)
А насчёт секрета ... так Вас вычислили ещё до того, как Вы его раскрыли :lol:
Автор:  Duke [ 16 окт 2014, 16:59 ]
Заголовок сообщения:  Re: Протокол фиксации клеток
balachoff писал(а):
Металлом предварительно покрыл. Но почему-то, их плохо видно. Всё-таки они довольно толстые. Хочу теперь попробывать метод заморафивания скалывания.

Эти белые полосы - это зарядка образца, они еще и бегают волнами небось по зонам зарядки. Если он покрыт, то явно недостаточно, либо находятся на непроводящей подложке. Сажать надо на стеклоуглерод или лучше металл. Контраста нету потому, что нету рельефа и нету достаточного слоя атомов для того ускоряющего напряжения, которое вы используете. Осадите их на полированный алюминиевый стабик и попробуйте посмотреть без напыления при ускоряющем 1кВ.
Если не получится, можно попробовать получить инвертированный контраст в BSE на ускоряющем 10-20кВ в низком вакууме. Это по сути должно дать аналогию просмотра клетки "на просвет" только с обращенным контрастом.
Страница 1 из 1 Часовой пояс: UTC + 3 часа
Powered by phpBB® Forum Software © phpBB Group
https://www.phpbb.com/