guddini писал(а):
Люди, Камрады, товарищи! Кто нибудь проводил т.н. "стандартные цитогенетические исследования в метафазных пластинках", в которых исследуются хромосомные мутации в гематологии? Вычитал в учебнике для ВУЗов "Основы гематологии", что данный метод реализуется с использованием световой микроскопии. В методе используется дифференциальная окраска метафазных хромосом (G-дифферециальная окраска) красителями Гимзы или Райта, при которой проявляется уникальная для каждой хромосомы поперечная исчерченность (G-полосы). Но в учебнике сам метод не описывается. Только общие фразы.
Мож кто знает, как его проводить?
Дифференциальные окраски хромосом
1. G-метод
1.1. G-окраска препаратов с использованием трипсина (Seabright M.,1971)
Перед окрашиванием стекла с препаратами помещают в термостат на ночь при t 60C.
Использованные реагенты:
-раствор трипсина: 10 mg кристаллического трипсина растворяют в 100 мл фосфатного буфера.
-раствор красителя: на 40 мл фосфатного буфера берется 7,5 мл красителя по Романовскому - Гимзе и 1,2 мл метанола.
-метанол.
Окрашивание: раствор трипсина подогревают до 370C (температура должна быть постоянная). В стаканчик с трипсином опускается стекло на 10-12 сек. Затем ополаскивается в стаканчике с метанолом и переносится в раствор красителем. Время окрашивания подбирается эмпирически, начиная с 6 сек. По истечении этого времени проводят контроль окрашивания под микроскопом при увеличении 40х, не смывая краситель со стекла. Если хромосомы бледно окрашены, увеличивают время окраски под контролем микроскопа. Если в хромосомах отсутствуют бенды, это значит, что время воздействия трипсина недостаточно, его следует увеличить при проведении процедуры со следующим стеклом. После достижения хорошего окрашивания препарат моют под проточной водой
1.2. G-окраска препаратов с использованием стандартного солевого раствора, или SSC (Sumner A et al., 1971)
Стекла помещают в емкость с 0,2 N HCL на 1 час при комнатной температуре. Каждое стекло промывают в трех порциях дистиллированной воды. Подсушивают стекла, ставя на ребро на фильтровальной бумаге. Каждое стекло проводят через подогретый до t60С 5%раствор Ва (ОН)2 в течение 10 сек. Стекла промывают в 0,1 N HCL и 3-х порциях дистиллированной воды, подсушивают. Помещают стекла в буферный раствор 2SSC и ставят их в термостат или водяную баню при t65C на 2 часа. Вынимают стекла из буферного раствора и подсушивают (на ребре) на фильтровальной бумаге. Окрашивают раствором красителя по Романовскому -Гимзе, приготовленном на фосфатном буфере из расчета 40 мл буфера и 3-7 мл красителя. Окрашивание производят несколько минут под контролем микроскопа. Время окрашивания подбирают, начиная с 1 мин. После окрашивания центромерные области должны быть интенсивно окрашены. После получения такой картины, препараты промывают водопроводной водой.
1.3. G-окраска без предварительной обработки препаратов (Селезнев Ю.В. 1972)
Препараты окрашивают раствором азур-эозина по Романовскому - Гимзе на фосфатном буфере с рН 6,8.Концентрация раствора и время окраски подбирается эмпирически.
2.2. Q-метод
2.1. Окраска препаратов акрихин-ипритом (QFQ)
Промыть стекло в дистиллированной воде, затем в буфере Мак-Ильвейна. Опустить стекло в стаканчик с красителем акрихин-ипритом на 10-20 минут. Промыть стекло в буфере Мак-Ильвейна. Заключить стекло в смесь глицерин-вода (1:1). После окрашивания хромосомы имеют диференцированность по длине, аналогичной в-бендированию,У-хромосома, спутники акроцентрических хромосом, центромерные районы 3 и 4 хромосом имеют сверх яркое (бриллиантовое)
2.2.2. Окраска препаратов флюорохромом Hoechst 33258 (Hilwig I., Gropp A., 1972)
Краситель готовят на сбалансированном растворе Хенкса с концентрацией флюорохрома 0,05 мкг/мл. Время окрашивания - 10 мин. Препарат промывают в воде и заключают в уксуснокислый буфер с рН 5,5. Для получения более четкой дифференцированности окрашенные препараты следует выдерживать в темноте в течение 3-7 дней.
2.3. R-метод
2.3.1 R-окраска с использованием термической обработки и красителя Романовского-Гимзы (Dutrillaux B., 1973; Dutrillaux B., Covic M.,m 1974)
Препараты инкубируют при температуре + 87°в растворе Эрла (рН 6,5). Время инкубации варьирует от 1,2-2ч для односуточных препаратов до 10 мин для препаратов месячной давности. Окраску производят раствором Романовского-Гимзы на фосфатном буфере с рН 6,7.Время и концентрация раствора подбирается эмпирически.
Приложение 3. Приготовление буферных растворов и красителей
3.1.Фосфатный буфер:
NaHPO4 - 11,8 г на 1 л дистиллированной воды;
KH2PO4 - 9,8г на 1 л дистиллированной воды.
Смешать растворы в соотношении 1:1; pH - 6,8.
3.2. Буфер Мак-Ильвейна:
Na2HPO4 - 72 г на 1 литр дистиллированной воды,
C6H8O7 (лимонная кислота) - 19 г/л.
Растворы смешать в соотношении 4:1, (или 42 мл + 58 мл соответственно).
3.3.Буфер 2хSSC:
NaC6H5O7 (лимонно-кислый натрий) 9г на 1 л дистиллированной воды;
NaCL - 18 г на 1 л дистиллированной воды;
Раствор смешать в соотношении 1:1, рН - 6,8.
3.4. Приготовление красителя акрихин-иприт:
Порошок акрихин-иприта на кончике скальпеля перенести в центрифужную пробирку и растворить в 1 мл дистиллированной воды, перемешивая стеклянной палочкой до полного растворения. Полученный раствор смешать с 200 мл буфера Мак-Ильвейна и 2 г NaCl.
3.5. Приготовление уксусно-кислого орсеина для окрашивания клеток букального эпителия:
В 100 мл подогретого до паров 65% раствора уксусной кислоты растворяется при подогревании и помешивании стеклянной палочкой 2 г порошка краски оссеина (не доводить до кипения!). После полного растворения раствор красителя охлаждается, фильтруется и через несколько дней готов к употреблению
Вход
Регистрация
FAQ
Поиск
