Часть 1
Модуляционно-контрастный микроскоп: принципы и характеристики
by ROBERT HOFFMAN, Adelphi University, Garden City, New York 11530, U.S.A. (Mud address: 17 Copper Beech Place, Merrick, New York 11566, U.S.A.)
Journal of Microscopy, Vol. 110, Pt 3, August 1977, pp. 205-222. paper accepted 5 July 1977
https://doi.org/10.1111/j.1365-2818.1977.tb00033.xАБСТРАКТ.
Микроскоп с модуляционным контрастом создает изображение с высокой степенью контрастности и разрешения. Конечное изображение имеет трехмерный вид, в котором округлый объект кажется темным с одной стороны, светлым с другой, с серым пространством между ними на сером фоне. К характеристикам системы модуляционного контраста относятся оптическое сечение, направленность света, высокое разрешение и контроль контрастности и когерентности. Светлопольный микроскоп превращается в микроскоп с модуляционным контрастом путем добавления в объектив модулятора - специального амплитудного фильтра. Перед конденсором размещена щелевая апертура, часть которой содержит поляризатор (частично поляризована). Ниже расположен вращающийся поляризатор. Модулятор обрабатывает свет от противоположных градиентов противоположно, то есть ярче для одного и темнее для другого; тем самым сохраняя знак. Теория дифракции была расширена, чтобы показать, что интенсивность градиентного изображения является интенсивностью нулевого порядка и при модификации модулятором создает высококонтрастное изображение.
Модулирующий контрастный микроскоп прост и удобен в настройке. Он используется в системах отраженного и проходящего света, с пластиковыми и стеклянными поверхностями, а также в сочетании с флуоресцентными системами и методами поляризации. Практически нет предела по типу образца, который можно исследовать этим методом.
ВВЕДЕНИЕ
Модулирующий контрастный микроскоп позволяет рассматривать прозрачные, неокрашенные и живые клетки с высоким контрастом. Эта система преобразует информацию о фазовом градиенте в вариации интенсивности изображения. Фазовые градиенты образуют округлые области прозрачных объектов. По интенсивности изображения противоположные градиенты противоположны. Один градиент темнее, а противоположный градиент светлее, чем среднее значение серого фона. Эта форма оптического затемнения приводит к появлению трехмерного изображения. В определенном диапазоне значений интенсивность изображения является функцией первой производной разности оптических путей прозрачного фазового объекта или геометрического контура непрозрачного объекта.
ХАРАКТЕРИСТИКИ СИСТЕМЫ
К рабочим характеристикам микроскопа с модуляционным контрастом относятся:
1) изображения с трехмерным внешним видом,
2) оптические сечения (секции)
3) направленная чувствительность к оптическим градиентам,
4) оптимальное изображение и
5) контраст и контроль когерентности.
Рисунок 1 представляет собой микрофотографию поверхности свежей человеческой эпителиальной клетки из выстилка рта, наблюдаемой через объектив Zeiss Neofluar 100x, модифицированный для модуляции контраста. При наблюдении в ярком поле этот прозрачный (фазовый) объект будет практически невидимым, потому что глаз или фотопленка не могут обнаружить фазовые вариации. Каждая бактерия выглядит как трехмерное изображение на сером фоне, где одна сторона темная, а противоположная сторона светлая с сероватым участком между ними. Когда интенсивность света изменяется выше и ниже среднего значения, говорят, что свет модулируется - отсюда и название «контраст модуляции».
Наша зрительная система интерпретирует эту форму оптического затенения как трехмерное изображение, которое подвержено иллюзии существования глубины в объекте. Некоторые наблюдатели могут рассматривать затенение как возвышенность (в образце), в то время как другие видят в нем впадину, или один наблюдатель может видеть его в любом направлении в разное время. Тем не менее, интенсивность изображения приближается к первой производной разности оптического пути прозрачного объекта или геометрического контура непрозрачного объекта (Hoffman & Gross, 1975a, 1976).
Изображения, создаваемые с помощью системы модулирующего контраста, не затеняются фазовым материалом выше и ниже плоскости фокуса. Каждый уровень глубины резкости четко обозначен, отражая объект только на этом уровне. Микрофотографии на рис.2, сделанные с помощью объектива Olympus 40x Planachromat свежей эпителиальной клетки с поверхности щеки человека показывают (а) складки мембраны и прилипшие бактерии на поверхности и (б) ядро клетки и цитоплазматические включения.
Модуляционно-контрастный микроскоп чувствителен к направлению оптических градиентов, при котором изображение оптически затеняется в направлении обнаружения максимального градиента. Эта направленность позволяет микроскописту определить направление градиента. На рис. 3 показан кристалл нитрата свинца, где оптический контур в центре кристалла едва виден по сравнению с рис. 3 (b), тот же кристалл повернут на 90 градусов.
Используется разрешающая способность любого объекта. Рисунок 4 демонстрирует разрешение пор Pleurosigma angulatum, полученное с помощью планахромата Zeiss 40x NA = 0,65. Изменение контраста и пространственной согласованности позволяет оптимально рассматривать объекты с широким диапазоном оптических градиентов. На рисунке 5 показана суспензия свежих эритроцитов человека, сравнивается правильная и неправильная настройка контраста и когерентности. На рис. 5 (б) контраст и когерентность были слишком высокими для этого объекта.
КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ
Светлопольный микроскоп легко модифицируется в систему модулирующего контраста путем добавления специальной щелевой апертуры для каждого конкретного объектива (с соответствующим увеличением) ниже конденсора и добавлением вращающегося поляризатора под щелевой апертурой. Модулятор помещается в объектив в плоскости, сопряженной со специальной щелевой апертурой (рис. 6, задняя фокальная плоскость объектива).
Модулятор имеет три области:
1) небольшую темную область (D) на одном краю с пропусканием менее 1% света
2) узкую серую область (G) приблизительно с 15% пропускания света и
3) остальную часть сопряженной плоскости (B) с 100% пропусканием света.
По существу, фазовые изменения, вносимые модулятором, отсутствуют. Специальная Щелевая апертура представляет собой частично щель, покрытую поляризатором P2 и отображающуюся на плоскость модулятора. При пересечении P1 и P2 эффективная щель становится узкой, и ее изображение регистрируется в серой области модулятора (G). Участок щели, управляемый поляризатором, регистрируется в яркой области модулятора (B). Вращение P1 изменяет контраст и пространственную когерентность. Щелевая апертура и серая область модулятора смещены от оптической оси, чтобы обеспечить максимальное разрешение. Когда щель удалена, объектив с модулирующим контрастом можно использовать для режимов светлого поля, темного поля, поляризации и флуоресценции. Система контрастирования с модуляцией пропускания может использоваться в сочетании с методами отраженной флуоресценции (Padnos, 1976).