Астрономия и микроскопия http://forum.shvedun.ru/ |
|
Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение http://forum.shvedun.ru/viewtopic.php?f=6&t=1581 |
Страница 5 из 51 |
Автор: | Rasalam [ 13 янв 2014, 09:51 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Сэм-59 писал(а): Кстати, обнаружил такую вещь. Если настроить освещение под 90х (изображение тела свечения на апертурной диафрагме, в поле зрения резко видна полевая диафрагма, иммерсия на конденсоре), то выходной зрачок объектива заполняется чуть больше чем наполовину (обнаружил, наблюдая в "фазовый телескоп"). Поднимая конденсор относительно этой настройки и увеличивая раскрытие полевой диафрагмы (?!) можно заполнить практически весь выходной зрачок. Так что считать лучшим вариантом настройки освещения: резкое изображений полевой диафрагмы или максимально заполненный зрачок? Странно как-то... заполнение выходного зрачка объектива регулируется раскрытием апертурной диафрагмы конденсора... хотя, даже с апланатическим конденсором настроить свет по Келеру с объективом 90х можно только очень условно, аберрации конденсора недостаточно исправлены, думаю, лучшим вариантом будет все же заполненный выходной зрачок объектива. А у вас апертурная диафрагма достаточно раскрыта? Т.к. степень заполнения зрачка регулируется только ею, ведь только она отображается в плоскости выходного зрачка объектива при настройке по Келеру. Сэм-59 писал(а): Это еще и из-за стекинга. Да, отчасти, но основную лепту вносит все же матрица веб-камеры. На видео кстати картинка приятнее смотрится, т.к. эта сглаженность менее заметна. |
Автор: | Сэм-59 [ 13 янв 2014, 10:03 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Rasalam писал(а): А у вас апертурная диафрагма достаточно раскрыта? Конечно! Раскрытие полевой диафрагмы дает увеличение заполнения зрачка при подъеме конденсора относительно настройки на резкость полевой диафрагмы при полностью открытой апертурной диафрагме. У меня, правда, не штатный для БИОЛАМа КОН-3 с вводимой доп. линзой, а какой-то другой конденсор А=1,2 (фамилии на нем нет). Кстати, подложил под препарат высокую металлическую шайбу (из разобранного жесткого диска, с хорошей плоскопараллельностью сторон), с объективом 9х попал в настройку по Келеру, цвета стали гораздо лучше! |
Автор: | epid [ 13 янв 2014, 11:02 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Можно пока вставить свой вопрос? Красил ли кто по Романовскому-Гимзе? Я в основном красил бактерий простыми методами (метиленовым синим), а также по Граму. Вот заинтересовался окраской сапрофитных простейших и спирохет ротовой полости. По инструкции надо выдержать в красителе Романовского-Гимзе (готовом растворе) 20-40 мин. Выдерживал 20-30 мин, прокрашивание ооочень слабое. Выдерживал час - тоже слабо. Один врач посоветовал на всю ночь оставить. Ротовые амебы окрасились неплохо, а вот спирохеты еле-еле. Может как-то спиртом (или формидроном?) предварительно обесцветить, а то я фиксирую по-старинке над пламенем горелки. |
Автор: | Rasalam [ 13 янв 2014, 11:31 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
epid писал(а): Можно пока вставить свой вопрос? Красил ли кто по Романовскому-Гимзе? Я в основном красил бактерий простыми методами (метиленовым синим), а также по Граму. Вот заинтересовался окраской сапрофитных простейших и спирохет ротовой полости. По инструкции надо выдержать в красителе Романовского-Гимзе (готовом растворе) 20-40 мин. Выдерживал 20-30 мин, прокрашивание ооочень слабое. Выдерживал час - тоже слабо. Один врач посоветовал на всю ночь оставить. Ротовые амебы окрасились неплохо, а вот спирохеты еле-еле. Может как-то спиртом (или формидроном?) предварительно обесцветить, а то я фиксирую по-старинке над пламенем горелки. Попробуйте чуть подкислить краситель (уксус) или сделать более щелочным (сода), там кроме времени окраски большое значение имеет рН красителя. А спирохеты в какой цвет окрасились ? |
Автор: | epid [ 13 янв 2014, 11:57 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
У меня они получились слабо голубого цвета. И то при длительной окраске. Знаю, что спирохеты в принципе слабо поддаются классическим окраскам. Но по Романовскому-Гимзе, пишут, вроде как должны неплохо окрашиваться. А у меня не хотят никак. |
Автор: | Rasalam [ 13 янв 2014, 12:03 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
epid писал(а): У меня они получились слабо голубого цвета. И то при длительной окраске. Знаю, что спирохеты в принципе слабо поддаются классическим окраскам. Но по Романовскому-Гимзе, пишут, вроде как должны неплохо окрашиваться. А у меня не хотят никак. Если слабо голубого цвета, то значит надо красить основными красителями, типа метиленовой синьки. Возможно Азур II их сильнее и не прокрасит. Попробуйте также зафиксировать препарат не в пламени а в этаноле. |
Автор: | epid [ 13 янв 2014, 12:05 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
А еще инструкция к красителю говорит, что необходимо развести концентрированный краситель с дистиллированной водой в пропорции 1:10. Я собственно так и делал. Может покрепче сделать, 1:5 к примеру? Бактерии конечно и в 1:10 здорово окрашиваются за полчаса, но со спирохетами сложнее. |
Автор: | epid [ 13 янв 2014, 12:08 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Rasalam писал(а): epid писал(а): У меня они получились слабо голубого цвета. И то при длительной окраске. Знаю, что спирохеты в принципе слабо поддаются классическим окраскам. Но по Романовскому-Гимзе, пишут, вроде как должны неплохо окрашиваться. А у меня не хотят никак. Если слабо голубого цвета, то значит надо красить основными красителями, типа метиленовой синьки. Возможно Азур II их сильнее и не прокрасит. Попробуйте также зафиксировать препарат не в пламени а в этаноле. А метиленовый синий вроде входит в состав. Или его побольше добавить? Я-то использую покупной готовый краситель (азур+эозин+метиленовый синий). |
Автор: | Rasalam [ 13 янв 2014, 12:17 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
epid писал(а): Rasalam писал(а): epid писал(а): У меня они получились слабо голубого цвета. И то при длительной окраске. Знаю, что спирохеты в принципе слабо поддаются классическим окраскам. Но по Романовскому-Гимзе, пишут, вроде как должны неплохо окрашиваться. А у меня не хотят никак. Если слабо голубого цвета, то значит надо красить основными красителями, типа метиленовой синьки. Возможно Азур II их сильнее и не прокрасит. Попробуйте также зафиксировать препарат не в пламени а в этаноле. А метиленовый синий вроде входит в состав. Или его побольше добавить? Я-то использую покупной готовый краситель (азур+эозин+метиленовый синий). А вы пробовали рН краски менять ? Поставьте опыт такой Концентрацию можно увеличить, только тогда то, что прокрашивалось раньше хорошо, будет наверное совсем темным. |
Автор: | epid [ 13 янв 2014, 12:27 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Нет, рН не пробовал менять, попробую. Параллельно поставлю с рН со сдвигом в ту и в другую сторону. А что другие микробы перекрасятся, это не беда, цель у меня в данном случае другая))) Тогда с учетом ваших рекомендаций сделаю так: 1. фиксация в этаноле 2. окраска более крепким раствором красителя (часа, думаю, 2-3, к примеру) 2а. окраска красителем с добавлением уксусной кислоты (параллельно) 2б. окраска красителем с добавлением соды (параллельно) |
Автор: | Rasalam [ 13 янв 2014, 13:06 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
epid писал(а): Нет, рН не пробовал менять, попробую. Параллельно поставлю с рН со сдвигом в ту и в другую сторону. А что другие микробы перекрасятся, это не беда, цель у меня в данном случае другая))) Тогда с учетом ваших рекомендаций сделаю так: 1. фиксация в этаноле 2. окраска более крепким раствором красителя (часа, думаю, 2-3, к примеру) 2а. окраска красителем с добавлением уксусной кислоты (параллельно) 2б. окраска красителем с добавлением соды (параллельно) И заодно прошу сообщить (если есть возможность - с фото) результаты ваших экспериментов. Интересно стало |
Автор: | Юрий [ 13 янв 2014, 13:29 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
epid писал(а): Можно пока вставить свой вопрос? Красил ли кто по Романовскому-Гимзе? Я в основном красил бактерий простыми методами (метиленовым синим), а также по Граму. Вот заинтересовался окраской сапрофитных простейших и спирохет ротовой полости. По инструкции надо выдержать в красителе Романовского-Гимзе (готовом растворе) 20-40 мин. Выдерживал 20-30 мин, прокрашивание ооочень слабое. Выдерживал час - тоже слабо. Один врач посоветовал на всю ночь оставить. Ротовые амебы окрасились неплохо, а вот спирохеты еле-еле. Может как-то спиртом (или формидроном?) предварительно обесцветить, а то я фиксирую по-старинке над пламенем горелки. по поводу спирохет, в окраске они очень прихотливы и окрашиваются краской по Романовскому — Гимзе T.pallidum окрашивается в розовй цвет( отсюда и название бледная трепонема), непатогенные трепонемы — в синий или фиолетовый. pH воды должен быть строго нейтральный, вода желательно бидистиллированая ( а лучше Деионизованная). По поводу фиксации над пламенен спиртовки, это скорей и портит вам окраску, только химическая фиксация! |
Автор: | Сэм-59 [ 13 янв 2014, 13:53 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
epid, прибавлять "на глаз" кислоту или щелочь - непродуктивно. Уровень рН должен соблюдаться достаточно строго. Поэтому стоит обзавестись чем-то для определения рН. Можно индикаторной бумагой, можно купить в аптеке тест-полоски для определения кислотности мочи (та же бумага, но с меньшим диапазоном определяемого рН), в идеале, конечно, рН-метр, тогда можно мерить и непосредственно в красителе. А краситель Романовского делают с расчетом на разведение в т.ч. и потому, что для разных объектов рекомендуется разный уровень рН, вот его и разводят соответственно забуференной водой. Юрий, а бидистиллят дает чисто нейтральную реакцию? Его рН не около 5? А нужно 7? |
Автор: | Юрий [ 13 янв 2014, 14:08 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Сэм-59 писал(а): . Юрий, а бидистиллят дает чисто нейтральную реакцию? Его рН не около 5? А нужно 7? В ТЕОРИИ 2dH2O, должен давать если перегонять на стекле(кварцевое стекло) близкое значение pH к 7+\-. Но проще конечно разводить краситель на буфере( фосфатном). Краситель романовского очень капризный и без соответствующего опыта с первого раза редко получается воспроизвести правильную цветовую картину. |
Автор: | epid [ 13 янв 2014, 16:12 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Юрий писал(а): по поводу спирохет, в окраске они очень прихотливы и окрашиваются краской по Романовскому — Гимзе T.pallidum окрашивается в розовй цвет( отсюда и название бледная трепонема), непатогенные трепонемы — в синий или фиолетовый. pH воды должен быть строго нейтральный, вода желательно бидистиллированая ( а лучше Деионизованная). По поводу фиксации над пламенен спиртовки, это скорей и портит вам окраску, только химическая фиксация! Все учту! Пока попробовал со слегка (на глаз) подкисленным красителем. Развел краситель с дистиллированной водой 1:5. Фиксировал в этаноле. Красил полным погружением в течение 2-х часов. Мазок промыл, просушил, завтра промикроскопирую. Завтра же попробую все то же, но без подкисления с измененной концентрацией раствора. Интересно как отреагировал препарат на повышение концентрации красителя. Вода у меня в наличии максимум просто дистиллированная. |
Страница 5 из 51 | Часовой пояс: UTC + 3 часа |
Powered by phpBB® Forum Software © phpBB Group https://www.phpbb.com/ |