Астрономия и микроскопия http://forum.shvedun.ru/ |
|
Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение http://forum.shvedun.ru/viewtopic.php?f=6&t=1581 |
Страница 19 из 51 |
Автор: | Юрий [ 28 сен 2014, 21:10 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
guddini писал(а): Вот жеж красят люди.... http://zoom.ronaldschulte.nl/mu02/TemplateWebPage.htm Это одна из прописей Окрашивание азаном по методу Гейденгайна ^ Окрашивание азаном по методу Гейденгайна – является модификацией метода Маллори, что позволяет получать более четкоеокрашивание соединительной ткани, чем основной метод. Данную методику хорошо использовать при окраске железистой и других тканей. Окраска срезов лучше удается после сулемовых фиксаторов (жидкость Ценкера и её модификация по Максимову), можно и после простой формалиновой фиксации материала. ^ Приготовление растворов: 1. Раствор азокармина – к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,1 г азокармина. Затем в течение нескольких минут кипятят и после охлаждения профильтровывают. К фильтрату добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты. ^ 2. Раствор анилинового синего и оранжевого G - к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г анилинового синего, 2,0 г оранжевого G. Смесь кипятят в течение 2-3 минут, охлаждают и профильтровывают. Перед употреблением раствор разводят в 2-3 раза дистиллированной водой. ^ 3. Раствор анилинового спирта – в 100 мл 90% спирта растворяют 0,1 мл анилинового масла (практически удобнее 1,0 мл анилинового масла растворить в 1 л спирта). 4. Уксуснокислый спирт – к 100 мл 96% спирта добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты. ^ 5. Раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты – 5 мг химически чистого препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Пропись окрашивания азаном по методу Гейденгайна Окрашивание срезов проводят следующим образом: 1. Срезы переносят в раствор азокармина и помешают на 1,5- 2 часа в термостат с температурой 56-60 градусов. Срезы для этого помешают в хорошо закрывающиеся биологические стаканчики (или бюксы) с притертой пробкой. 2. Далее стаканчик со срезами охлаждают при комнатной температуре в течение 10-15 минут. 3. Срезы извлекают из стаканчиков (или бюкса), ополаскивают в дистиллированной воде. 4. Срезы переносят в раствор анилинового спирта и выдерживают до тех пор, пока не будут четко выявлены ядра (контроль под микроскопом). Если не удается долго выявить ядра, можно добавить в раствор дистиллированной воды, что ускорит процесс дифференцировки; 5. После дифференцировки ядер быстро промыть в течение 1-2 минуты уксуснокислым спиртом. 6. Протрава срезов в растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты в среднем в течении 1-3 часов в зависимости от выявления элементов соединительной ткани под контролем микроскопа. 7. Ополаскивание в дистиллированной воде и переносят в разведенный раствор анилинового синего и оранжевого G – в течение 2-3 часов, после чего быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят в 96% спирт для дифференцировки. Результаты: при правильной дифференцировке коллагеновые и ретикулиновые волокна окрашиваются в синий цвет при отсутствии общего голубого тона, ядра клеток - в красный цвет. Мышечная ткань – в различные оттенки красно-оранжевого цвета. |
Автор: | guddini [ 28 сен 2014, 21:27 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Юрий писал(а): Это одна из прописей Спасибо. Для меня эти прописи - жесть суровая)))). Трудно самому осваивать на собственных ошибках. Окрашивание азаном по методу Гейденгайна Rasalam писал(а): guddini писал(а): Надыбал фиолетовые чернила Радуга? Их можно как нибудь использовать в качестве красителя? Где-то читал, что фиолетовые чернила - генцианвиолет, если да, то можно попробовать покрасить бактерии по Грамму. Я тоже где-то слышал. Но как правильно их (чернила) приготовить не знаю. В чистом виде использовать, или разводить их надо? Какая экспозиция? Может кто подскажет? Мне кажется Сэм-59 или Актис про это что-то знают. |
Автор: | adam [ 29 сен 2014, 02:57 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
guddini писал(а): Юрий писал(а): Это одна из прописей Спасибо. Для меня эти прописи - жесть суровая)))). Трудно самому осваивать на собственных ошибках. Окрашивание азаном по методу Гейденгайна Rasalam писал(а): guddini писал(а): Надыбал фиолетовые чернила Радуга? Их можно как нибудь использовать в качестве красителя? Где-то читал, что фиолетовые чернила - генцианвиолет, если да, то можно попробовать покрасить бактерии по Грамму. Я тоже где-то слышал. Но как правильно их (чернила) приготовить не знаю. В чистом виде использовать, или разводить их надо? Какая экспозиция? Может кто подскажет? Мне кажется Сэм-59 или Актис про это что-то знают. Совершенно верно, фиолетовые чернила содержат генцианвиолет, если для окраски по Грамму, то можно и не разводить, всё равно будете промывать и дифференцировать спиртом. А для других целей, поскольку сейчас грибной сезон, попробуйте данными фиолетовыми чернилами, но уже в разведении( я разводил очень сильно) окрасить срез гриба - споры окрашиваются просто великолепно, у меня такой препарат в глицерине полгода сохранялся. |
Автор: | Евгений251082 [ 29 сен 2014, 13:24 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
guddini писал(а): Мазок крови допустимо фиксировать в ацетоне, или не надА? - из практики, если не предусматривается особая цитохимия, то мазки крови лучше всего фиксировать 96-95% этанолом (он же этиловый спирт) - обычный аптечный спирт, раньше был без рецепта, сейчас по рецепту. Но не во всех аптеках, да и взять рецепт на него особо не сложно у терапевта, он проходит как тривиальный антисептик. Т.е. тонким слоем макс в несколько мм заливаем плашмя уложенные мазки спиртом, ждём полного испарения оного, высыхания полного мазков и после этого, пожалуйста, окрашиваем на лейкограмму (лейкоформулу) или на другие структуры, но подчёркиваю, на те, где нет особых указания по процедуре фиксации мазков цельной крови. |
Автор: | guddini [ 29 сен 2014, 15:47 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Евгений251082 этанола у меня хоть залейся - не ограниченное количество в прямом смысле. Как мазки фиксировать в этаноле я знаю. Мне бы узнать, как эти чернила "Радуга" правильно развести, что бы лишнего не лить. На сколько мне известно Сэм-59 их использовал весьма успешно. |
Автор: | Евгений251082 [ 29 сен 2014, 17:36 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
guddini писал(а): Евгений251082 этанола у меня хоть залейся - не ограниченное количество в прямом смысле. Как мазки фиксировать в этаноле я знаю. Мне бы узнать, как эти чернила "Радуга" правильно развести, что бы лишнего не лить. На сколько мне известно Сэм-59 их использовал весьма успешно. - На счёт чернил не знаю))), но в любой лабе лучше попросить метиленовый синий и (или) генциан-виолет и усё))). Зачем вам эти чернила, тем более за временем, они потеряли многие свойства, коллоидность, в т.ч. на счёт красящих свойств не знаю. Попробуйте, если будут интересные результаты, обязательно сфотографируйте и продемонстрируйте |
Автор: | Сэм-59 [ 30 сен 2014, 16:08 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
guddini писал(а): ..Мне бы узнать, как эти чернила "Радуга" правильно развести, что бы лишнего не лить... Уважаемый guddini, фиолетовые чернила "Радуга" для авторучек в своем составе имеют кристаллвиолет (очень близок к генцианвиолету), воду и глицерин; со временем не заметил, чтобы они портились; возможно, стоит добавить в них чуть-чуть фенола (оно же карболка, будет карболовый кристаллвиолет) и профильтровать. Для окраски по Граму разводить не надо; "чернильную пропись" см. в этой же ветке viewtopic.php?f=6&t=1581&start=120#p25176. А для мицелия грибов, спор и растительных клеток - разведение нужно подбирать опытным путем с учетом последующей дифференцировки. |
Автор: | Сэм-59 [ 28 ноя 2014, 12:07 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Коллеги, у кого есть практический опыт заключения препаратов в полистирол? Сделал раствор полистирола с пластификатором ДБФ, как рекомендовано в viewtopic.php?f=6&t=1351&start=45#p21353. На практике получаю следующее: 1. Реальное время отвердения массы - до 3 суток; по периметру покровного стекла пленка действительно отвердевает достаточно быстро, за 20-30 минут. А под стеклом остается жидкая среда; при надавливании на стекло видно, как она перетекает. А в источнике указано время отвердения 1,5-2 часа... "Но это еще нэ бэда, учитэль" (С). 2. "Бэда, учитэль, это когда" (С) по мере отвердения (высыхания ксилола) объем среды значительно уменьшается, и под покровным стеклом возникают пустоты. Если капать объем среды "с запасом на усушку", то покровное стекло застывает в позе "как Бог на душу положит", а не параллельно предметному. В общем, есть ли какие-то тонкости этой процедуры, без учета которых результат будет "кривой"? |
Автор: | Юрий [ 28 ноя 2014, 13:15 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Сэм-59 писал(а): Коллеги, у кого есть практический опыт заключения препаратов в полистирол? Сделал раствор полистирола с пластификатором ДБФ, как рекомендовано в viewtopic.php?f=6&t=1351&start=45#p21353. На практике получаю следующее: 1. Реальное время отвердения массы - до 3 суток; по периметру покровного стекла пленка действительно отвердевает достаточно быстро, за 20-30 минут. А под стеклом остается жидкая среда; при надавливании на стекло видно, как она перетекает. А в источнике указано время отвердения 1,5-2 часа... "Но это еще нэ бэда, учитэль" (С). 2. "Бэда, учитэль, это когда" (С) по мере отвердения (высыхания ксилола) объем среды значительно уменьшается, и под покровным стеклом возникают пустоты. Если капать объем среды "с запасом на усушку", то покровное стекло застывает в позе "как Бог на душу положит", а не параллельно предметному. В общем, есть ли какие-то тонкости этой процедуры, без учета которых результат будет "кривой"? Используем и успешно. В практической патоморфологии широко используют синтетическую пластмассу — полистирол. Способ применения этого пластического материала предложен Д.С. Саркисовым и подробно изложен в руководстве Г.А. Меркулова «Курс патолого-гистологической техники» (1969). Полистирол хорошо растворяется в ксилоле и толуоле, прозрачен и быстро затвердевает под предметным стеклом, образуя тончайшую пленку. Метод растворения тот же, что и для смол растительного происхождения. Однако со временем полистирол становится хрупким, в пленке появляются трещины, что затрудняет микроскопическое исследование и совершенно неприемлемо для микросъемки. Для предотвращения этих недостатков в 30 % раствор полистирола в ксилоле добавляют пластификатор, придающий пленке эластичность и гибкость, устраняя все недостатки полистирола. В настоящее время в качестве пластификатора используют дибутилфталат, широко применяемый в электронной микроскопии. Существует несколько вариантов приготовления полистирола для заключения препаратов: 1) 94 мл 30 % раствора полистирола в ксилоле смешивают с 6 мл дибутилфталата; 2) смесь, состоящую из 100 г полистирола, 100 мл ксилола и 12 мл дибутилфталата, растворяют при 22 °С или в термостате при 37 °С, периодически перемешивая. Готовую синтетическую смолу хранят в плотно закрытой посуде. Технология заключения срезов та же, что и при применении основных сред. |
Автор: | Евгений251082 [ 28 ноя 2014, 13:23 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Или покупайте канадский бальзам (оригинальный), в проверенных магазинах лабораторной посуды и оборудования. В крупных городах такие магазины всегда есть. Там, обычно этот препарат заказывают у поставщиков, т.к. он, по понятным причинам весьма специфичен, но с его покупкой обычно нет никаких хлопот. Единственное, он дороговат. Но зато лишен всех недостатков полистирола и к тому же, действительно проверен веками. Сам пользуюсь им, скоро снова придётся заказывать. |
Автор: | Юрий [ 28 ноя 2014, 14:15 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Евгений251082 писал(а): Или покупайте канадский бальзам (оригинальный), в проверенных магазинах лабораторной посуды и оборудования. В крупных городах такие магазины всегда есть. Там, обычно этот препарат заказывают у поставщиков, т.к. он, по понятным причинам весьма специфичен, но с его покупкой обычно нет никаких хлопот. Единственное, он дороговат. Но зато лишен всех недостатков полистирола и к тому же, действительно проверен веками. Сам пользуюсь им, скоро снова придётся заказывать. канадский бальзам заменить нечем, с этим не поспоришь. Но у него есть недостатки -это цена(Канадский бальзам Panreac две недели назад покупал, 1л- 213Евро, 100 мл-30 евро). Полистирол вещь хорошая в патоморфологиии, без него никуда, нужно просто экспериментировать с сортами полистирола.. |
Автор: | Евгений251082 [ 28 ноя 2014, 14:21 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Юрий писал(а): Евгений251082 писал(а): Или покупайте канадский бальзам (оригинальный), в проверенных магазинах лабораторной посуды и оборудования. В крупных городах такие магазины всегда есть. Там, обычно этот препарат заказывают у поставщиков, т.к. он, по понятным причинам весьма специфичен, но с его покупкой обычно нет никаких хлопот. Единственное, он дороговат. Но зато лишен всех недостатков полистирола и к тому же, действительно проверен веками. Сам пользуюсь им, скоро снова придётся заказывать. канадский бальзам заменить нечем, с этим не поспоришь. Но у него есть недостатки -это цена(Канадский бальзам Panreac две недели назад покупал, 1л- 213Евро, 100 мл-30 евро). Полистирол вещь хорошая в патоморфологиии, без него никуда, нужно просто экспериментировать с сортами полистирола.. Ну да, так и есть..., он дорогой, для любителя это мало приемлемо, но я буду его брать для научной работы, поэтому придётся затянуть пояс)). Да, кстати, в некоторых руководствах читал что в связи с собственной pH, сам канадский бальзам не подходит для некоторых особо чувствительных к кислотно основному равновесию цитохимических методов. Но это, только для узкой специфики. Для общей гистологии, для тотальных препаратов зоологических объектов, это лучший вариант (практически - янтарь!), но очень дорогой, да. |
Автор: | Юрий [ 28 ноя 2014, 14:23 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Евгений251082 писал(а): Юрий писал(а): Евгений251082 писал(а): Или покупайте канадский бальзам (оригинальный), в проверенных магазинах лабораторной посуды и оборудования. В крупных городах такие магазины всегда есть. Там, обычно этот препарат заказывают у поставщиков, т.к. он, по понятным причинам весьма специфичен, но с его покупкой обычно нет никаких хлопот. Единственное, он дороговат. Но зато лишен всех недостатков полистирола и к тому же, действительно проверен веками. Сам пользуюсь им, скоро снова придётся заказывать. канадский бальзам заменить нечем, с этим не поспоришь. Но у него есть недостатки -это цена(Канадский бальзам Panreac две недели назад покупал, 1л- 213Евро, 100 мл-30 евро). Полистирол вещь хорошая в патоморфологиии, без него никуда, нужно просто экспериментировать с сортами полистирола.. Ну да, так и есть..., он дорогой, для любителя это мало приемлемо, но я буду его брать для научной работы, поэтому придётся затянуть пояс)). Да, кстати, в некоторых руководствах читал что в связи с собственной pH, сам канадский бальзам не подходит для некоторых особо чувствительных к кислотно основному равновесию цитохимических методов. Но это, только для узкой специфики. Для общей гистологии, для тотальных препаратов зоологических объектов, это лучший вариант (практически - янтарь!), но очень дорогой, да. Да, для окраски по Романовскому канадский не подходит, выцветает препарат за год |
Автор: | adam [ 28 ноя 2014, 15:20 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
Евгений251082 писал(а): Или покупайте канадский бальзам (оригинальный), в проверенных магазинах лабораторной посуды и оборудования. В крупных городах такие магазины всегда есть. Там, обычно этот препарат заказывают у поставщиков, т.к. он, по понятным причинам весьма специфичен, но с его покупкой обычно нет никаких хлопот. Единственное, он дороговат. Но зато лишен всех недостатков полистирола и к тому же, действительно проверен веками. Сам пользуюсь им, скоро снова придётся заказывать. Можно попробовать и даммарный лак, в руководстве по микротехнике Кисели отмечается, что в отличие от канадского бальзама, даммарный лак имеет нейтральный pH( т.е. именно отмечается отсутствие влияния на окраску) и отвердевает он быстрее. Я пользуюсь даммарным лаком от "Невской палитры"(магазины для художников ), единственно, его необходимо упарить наполовину( не менее) поскольку жидкий, на что уйдёт полгода. Не знаю, но мне нравится. |
Автор: | Евгений251082 [ 28 ноя 2014, 15:32 ] |
Заголовок сообщения: | Re: Подготовка препаратов: фиксация. окраска, заключение |
adam писал(а): Можно попробовать и даммарный лак,.... Спасибо, да, читал о таком. Посмотрим, как понимаю, это тоже смола от хвойного дерева. Когда был студентом, поступал вообще просто))). Собирал смолу сосны обыкновенной, смешивал её с ксилолом или толуолом доводил до жидкого состояния, фильтровал, и упаривал - склянку со смолой закрывал фильтровальной бумагой, завязывал нитками (чтоб растворитель испарялся и в то же время пыль не попадала). Короче, голь на выдумку хитра))). Знаю, по ряду показателям, она гораздо хуже канадской сосны и даммары, сохнет ооочень долго..., но препараты тотальные и некоторые срезы (гистосрезы) с начало двух тысячных до сих пор хранятся в отличном состоянии. Но это делал из безвыходности, возможности достать именно, канадский, или тот же даммарский бальзам, никакой возможности не было, а хотелось, по человечески сделать "вечные" постоянные тотальные и срезы микропрепараты гельминтов, когда работал над курсовыми, а потом над дипломной, по зоологии)). |
Страница 19 из 51 | Часовой пояс: UTC + 3 часа |
Powered by phpBB® Forum Software © phpBB Group https://www.phpbb.com/ |