Юрий писал(а):
Сэм-59 писал(а):
Решил попробовать изготовить парафиновые срезы, т.к. нежные ткани без заливки резать очень трудно.
На пробу взял корень фаленопсиса (хотя его можно было бы резать и без заливки, он достаточно плотный). Зафиксировал в ФАА. Проводка: спирт 70%, спирт 85%, спирт 96%, две смены изопропилового спирта, ксилол, раствор парафина в ксилоле, расплавленный парафин. Парафин использовал аптечный. Затем заливка в цилиндры диаметром 18 мм (под размер держателя моего "микротома", сделал два блока).
Делал поперечные срезы. Резал опасной бритвой, угол заточки 20 градусов. Проблема: срез скручивается в трубочку. Чем тоньше срез, тем сильнее. Даже при немедленном переносе в теплую воду далеко не каждый срез расправляется, особенно которые тоньше 20 мкм. Немного подогревал парафиновые блоки (до 30-35 градусов), но это не сильно помогало. Лезвие, разумеется, смачивал. Может, кто-до даст совет, как с этим бороться.
Срезы вылавливал из воды на обезжиренное покровное стекло. После высыхания срезы держались на стекле. Вся дальнейшая обработка была с покровным стеклом - мне так удобнее обрабатывать, в мои баночки предметные не помещаются. Отмывка от парафина в трех сменах ксилола. Проводка с спиртах 96%, 85%, 70%, 50%, 30%. Окраска "почти по Этцольду" - как в предыдущих моих опытах. Обезвоживание в глицерине, заключение в глицерин-желатину.
К сожалению не могу сказать с полной уверенностью так как не знаком с заливкой растительного материала, но дело в парафине, его точка плавления должна лежать от 48 до 56 градусов.
Попробуйте парафин прогреть несколько раз основательно( начнет дымить), а затем вылив в плоское охлажденное с низу судно. или добавить воска до 3-4 % от массы.
Будьте аккуратны с прогреванием парафина, может загореться.
Проблема скручивания парафина при резке - толщина среза, если она больше 10 -15 µm, то скручивания Вы не избежите.( из немецкого форума по микроскопии -mikroskopie-forum.de(
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10480.0 - это другая ссылка из этого форума, иллюстрированный процесс окраски).)Помимо воска, для улучшения пластичности парафина, можно добавить аптечный димексид - он же диметилсульфоксид, кстати, он великолепно увеличивает саму пенетрацию, т.е. можно его добавлять и в фиксаторы( из форумов судебных медиков).
Цитата:
Зарубежные фирмы производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий различные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид. Их коммерческие названия «Парапласт», «Парапласт плюс», «Гистопласт С», «Гистозес».
-
http://www.forens-med.ru/book.php?id=515----------------------
Впрочем, по первой немецкоязычной ссылке
Цитата:
In der Histologie und Pathologieist eine Schnittdicke von 4 bis 5 µm schoneher dick. .Für einen guten Schnitt empfehle ich:
- Gutes Qualitäts-Paraffin verwenden (Paraplast lässt sich sehr gut schneiden)
- Blöcke eine Nacht kühlen im Kühlschrank und erstunmittelbar vor dem Einspannen aus dem Schrank holen
В гистологии и патологии толщина среза от 4 до 5 µm уже достаточно значительна.( Прим. но это для животных тканей, для растительных 10 - 15 µm)
Для получения хорошего среза я рекомендую:
-Качественный парафин( Парапласт великолепно режется)
-Блоки перед резкой в течение ночи охладить в холодильнике и достать оттуда непосредственно перед креплением.