guddini писал(а):
Понял. Спасибо.
могу сказать еще одно что придется делать немыслимый объем работы:Актуальность изучения олигодендроцитов в норме и при психической патологии определяется их многосторонним влиянием на функцию нейронов, аксонов и
капилляров. Известно, что олигодендроциты в сером веществе коры головного мозга тесно прилежат к телам нейронов, являясь перинейрональными сателлитами
(Снесарев П.Е., 1950, Peters A. et al., 1976). В белом веществе они формируют миелиновые оболочки аксонов. Кроме того, олигодендроциты в сером и белом
веществе являются спутниками кровеносных капилляров, располагаясь в виде цепочек вдоль последних (Снесарев П.Е., 1950, Ambrosi G. et al., 1995, Peters A.,
1996). Установлено, что эти клетки осуществляют трофическую поддержку нейронов, принимают участие в обеспечении пластических процессов в центральной нервной
системе (Манина А.А., 1971, Dai X. et al., 2003, Wilkins A. et al., 2003). В последнее время была выдвинута гипотеза о важной роли этих клеток и в обеспечение высшей
нервной деятельности у человека и животных (Ройтбак А.И., 1993, Боголепова И.Н. и соавт., 1994, Оржеховская Н.С., 1996).
Подсчет численной плотности олигодендроцитов. Срезы изучали в световом микроскопе Reichert Polyvar (Австрия) с иммерсионным объективом 100 х
(N.A. = 1.40). Поля 9 и 10 префронтальной коры и их слои идентифицировали по цитоархитектоническим критериям, описанным С.А. Саркисовым и соавт. (1949).
Олигодендроциты идентифицировали по их маленькому округлому или овальному ядру (5-7 мкм в диаметре) с компактным хроматином и по узкому ободку светлой
цитоплазмы. Изображение из микроскопа при помощи видеокамеры передавалось на видеомонитор персонального компьютера. Обработку полученного изображения
проводили на экране видеомонитора при помощи программы Image Expert, (FEI Company). Для измерения перемещения объектива относительно оси Z на корпусе
микроскопа был укреплен механический микрокатор ИГП (Россия). Численную плотность (Nv) олигодендроцитов в единице объема ткани определяли методом
оптического диссектора (Gundersen H.J.G et al., 1998). Метод основан на получение серии тонких параллельных «оптических срезов» внутри толстого среза путем
перемещения плоскости фокуса изображения вдоль оси Z с одинаковым шагом 0,75 мкм (рис. 1) Толщину оптического среза, которая равна расстоянию между шагами, измеряли
при помощи микрокатора. Изображение оптического среза выводили на экран монитора, и на это изображение накладывали тестовую рамку, в которой
подсчитывали число олигодендроцитов. Сумма всех оптических срезов и является оптическим диссектором, который можно представить в виде параллелелепипеда.
Численную плотность олигодендроцитов подсчитывали по формуле: Nv =Q/V (дисс), где Q – среднее число клеток на диссектор и V (дисс) – объем
диссектора. Объем диссектора V=А´ h где А – площадь тестовой рамки и h -толщина оптического диссектора.
В данной работе использовали тестовую рамку размером 0,05 мм х 0,065мм = 0,00325мм2, толщина одного оптического среза составляла 0,75 мкм. Всего получали
9 оптических срезов на диссектор, таким образом, его толщина была 6,75мкм, а толщина срезов выше и ниже диссектора, в которых подсчет клеток не проводился,
была 0,5мкм. Тестовую рамку накладывали на изображение слоя VI (или подлежащего белого вещества) случайным образом, и затем проводили подсчет
олигодендроцитов внутри оптического диссектора, после чего тестовую рамку перемещали с равным интервалом (3 рамки) вдоль слоя VI (или подлежащего белого
вещества). Число клеток подсчитывали в 10 оптических диссекторах на одном срезе.
Таким образом, подсчет был проведен в 100 диссекторах для слоя VI и в 100 диссекторах для подлежащего белого вещества для каждого случая. Для коллекции
лаборатории клинической нейроморфологии НЦПЗ РАМН число подсчитанных диссекторов в каждой группе составило 32 000 + 32 000 = 64 000. Общее число
подсчитанных диссекторов 128 000. Для коллекции медицинского научно- исследовательского института Стенли число подсчитанных диссекторов в каждой группе составило 15 000 + 15 000 = 30 000. Общее число подсчитанных диссекторов 120 000. Nv олигодендроглиоцитов выражали как число клеток в 0,001мм3.
Измерение площади нейронов и числа перинейрональных олигодендроцитов. Срезы исследовали в световом микроскопе Reichert Polyvar (Австрия) c иммерсионным объективом 100 х (N.A.= 1.40). Для измерения площади нейронов и числа перинейрональных олигодендроцитов систематическим случайным
способом отбирали 10 пирамидных нейронов с ясно видимым ядрышком в каждом из трех подслоев слоя III, и заносили в память компьютера в виде файлов изображения.
Для каждого случая такую выборку осуществляли на 10 препаратах. Таким образом, число нейронов, выбранных для каждого случая, составило 300, для группы 4 500,
общее число отобранных нейронов составило 18 000. В выбранных изображениях измеряли площадь тела нейрона и подсчитывали число прилежащих к этому нейрону
олигодендроцитов. Учитывали только те олигодендроциты, которые находились на расстоянии меньше 5мкм от нейрона. Расстояние 5мкм было выбрано в силу того
что, что средний диаметр ядра олигодендроцита составляет 5мкм, цитоплазма его очень тонкая, слабо видимая при окраске по Нисслю, и поэтому ядро практически
прилежит к телу нейрона. Для измерения площади тела нейрона тональное серое изображение преобразовывали в бинарное, черно-белое. Площадь нейрона измеряли с
помощью алгоритма перевода пикселей в квадратные микроны. Число перинейрональных олигодендроцитов выражали как число клеток на нейрон.
Подсчет численной плотности перикапиллярных олигодендроцитов. Измерение численной плотности перикапиллярных олигодендроцитов проводили при
помощи светового микроскопа Reichert Polyvar (Австрия) с объективом 25/0,45. В каждом срезе в слое V отбирали 10 прямолинейных сегментов капилляров путем
систематического случайного отбора. Таким способом из каждого случая было отобрано 100 прямолинейных сегментов капилляров, итого 3 200 сегментов на
группу. Общее число отобранных сегментов капилляров составило 6 400. Измеряли длину каждого сегмента, подсчитывали число олигодендроцитов вдоль сегмента, и
численную плотность перикапиллярных олигодендроцитов выражали как число клеток на 0,01мм длины капилляра.
Вход
Регистрация
FAQ
Поиск
